La chiesa valdese di Pisa nasce negli anni '60 del XIX secolo, accogliendo una comunità che è già viva in città da qualche decennio. Della comunità iniziale fanno parte alcuni stranieri, fra cui un gruppo di commercianti engadinesi, ed un certo numero di pisani, che già nella prima metà del secolo avevano iniziato a riunirsi per “culti domestici” e ad impegnarsi nella diffusione di opuscoli divulgativi e di Bibbie in italiano. A Pisa un forte contributo alla formazione di una comunità evangelica era stato dato dalla permanenza in città, dal 1831 al 1846, di Matilde Calandrini (1794-1866), una ginevrina discendente da una delle famiglie protestanti lucchesi che dopo la Controriforma erano fuggite all'estero.
Matilde CalandriniMatilde viene a Pisa per motivi di salute, in cerca di un clima più mite. Dotata di una vera passione per l'educazione infantile, si adopera per avviare a Pisa asili e scuole per le classi meno abbienti. In questo trova un valido alleato in Luigi Frassi (1775-1838), che già nel 1820 aveva avviato una scuola, che però ebbe breve vita, e che nel 1834 fondò la Cassa di Risparmio di Pisa. Gli attuali asili comunali di Pisa sono il frutto dell'attività iniziata dalla Calandrini e dal Frassi. Rispettosa della fede degli altri, nelle sue scuole Matilde si astiene dal fare proselitismo religioso e i bambini cattolici vi recitano l'Ave Maria e si fanno il segno della croce. È invece nel suo salotto, dove ogni sera faceva un culto domestico consistente in una lettura della Bibbia ed in una preghiera ad alta voce, che finì per favorire, quasi involontariamente, la formazione di una comunità evangelica pisana. Il suo salotto era frequentato dalla sua cerchia di conoscenze: persone desiderose di impegnarsi nell'opera di alfabetizzazione e di diffusione della cultura anche fra le classi più umili e, più in generale, molti liberali del tempo. Matilde fu dunque l'elemento aggregatore di persone che si stavano avvicinando spontaneamente alle idee evangeliche e di cattolici desiderosi soprattutto di rinnovare la loro Chiesa, inclusi alcuni sacerdoti. Fra i frequentatori, oltre a Luigi Frassi e Piero Guicciardini, si ricordano, in particolare:
Tito Chiesi (1805-1886), procuratore al tribunale di Pisa e Lucca ed alla Corte d'Appello di Lucca, molto attivo già sotto il Granducato nella produzione e diffusione di stampa evangelica, dal 1842 impegnato in un'opera di assistenza spirituale nelle carceri di Pisa e successivamente una delle figure principali della Chiesa Valdese di Pisa e membro del Comitato di Evangelizzazione dal 1873 al 1875 e dal 1880 al 1886;
Giuseppe Montanelli (1813-1862), dal 1840 professore di diritto presso l'Università di Pisa, capo del governo costituzionale toscano dal 27 ottobre 1848 al 12 aprile 1849; col passare degli anni i suoi entusiasmi evangelici si spegneranno e ritornerà alla Chiesa Cattolica;
Enrico Mayer (1802-1877), nato a Livorno da una famiglia evangelica tedesca, patriota, studioso eclettico, fondatore, nel 1833, della Società degli Asili di Livorno, collaboratore della rivista “Guida dell'Educatore” di Raffaello Lambruschini e in seguito membro della chiesa valdese di Pisa.
Nel 1846 Matilde Calandrini viene espulsa dal Granducato di Toscana: dietro pressione di ambienti cattolici, le viene proibita la prosecuzione delle attività pedagogiche e le viene revocato il permesso di soggiorno.
Con il 1848 e l'avvento del governo costituzionale, arrivano in Toscana i primi pastori valdesi. Uno di questi, Bartolomeo Malan, viene invitato da Tito Chiesi a predicare a Pisa e continua fino a tutto il 1850.
I guai per gli evangelici toscani iniziano con la restaurazione che segue la parentesi costituzionale del 1848/49, quando il Granduca compie una svolta in senso reazionario, abbandonando i principi illuminati che fino allora avevano caratterizzato il governo suo e dei suoi predecessori. Nel 1856 viene reintrodotta in Toscana la pena di morte, che era stata abolita da Pietro Leopoldo il 30 novembre 1786, per punire “chiunque ha suscitato una sollevazione, anche profittando di un tumulto, sorto per altro scopo, o si è messo alla testa della medesima, per distruggere o alterare in Toscana la Religione dello Stato”. I culti in italiano sono proibiti nel gennaio del 1851. Per esser stati sorpresi a celebrare culti domestici, già nella primavera del 1851 sono arrestati ed espulsi dalla Toscana Piero Guicciardini ed il pastore valdese Paolo Geymonat. Peggior sorte tocca ai coniugi Madiai, albergatori fiorentini arrestati il 17 agosto 1851 perché sorpresi a leggere la Bibbia in casa propria insieme a tre amici: entrambi sono condannati a più anni di carcere, anche se poi, in seguito alle pressioni esercitate sul Granduca dai paesi protestanti, anche loro sono scarcerati ed espulsi.